Описание
Проведение обратной транскрипции и ПЦР в одной пробирке позволяет сократить время подготовки и проведения реакции, а также снизить вероятность контаминации за счет уменьшения количества манипуляций с образцом. Одностадийную ОТ-ПЦР чаще всего используют для одновременной обработки большого количества образцов РНК.
Наборы и смесь OneTube можно использовать для решения задач:
— Анализ экспрессии генов,
— Обнаружение и количественная оценка вирусов,
— Количественная оценка РНК или ДНК и т.п.
— При одноэтапной стратегии вся синтезирующаяся кДНК попадает в ПЦР и недоступна для других приложений.
Формат наборов OneTube RT-PCR TaqMan и OneTube RT-PCR SYBR предусматривает контроль пробы РНК на присутствие примеси геномной ДНК в реакции без ревертазы. Раздельная комплектация ревертазы и ПЦР-смеси позволяет точечную оптимизацию состава реакционной смеси в зависимости от задачи.
Готовая смесь OneTube RT-PCRmix содержит ревертазу и ПЦР-смесь в одной пробирке. Соотношение компонентов оптимально для рутинной постановки ОТ-ПЦР .
Основные свойства
Термостабильная ревертаза (55°С) обладает высокой процессивностью и точностью синтеза кДНК, лишена активности РНКазы H;
HS Taq ДНК-полимераза «с горячим стартом» обладает 5′ → 3′ полимеразной и экзонуклеазной активностью;
Все компоненты оптимизированы для длительного хранения в замороженном виде и допускают до 10 циклов размораживания;
Детекция накопления ПЦР-продукта происходит в режиме реального времени:
— с использованием флуоресцентных зондов типа TaqMan (набор OneTube RT-PCR TaqMan, смесь OneTube RT-PCRmix);
— с помощью интеркалирующего красителя (набор OneTube RT-PCR SYBR, смесь OneTube RT-PCRmix – при добавлении SYBR Green I ).
Преимущества
— Сниженная вероятность контаминации по сравнению с двухстадийным протоколом синтеза кДНК;
— Увеличенная специфичность за счет термостабильной ревертазы и «горячего старта» амплификации;
— В одном анализе могут определяться как РНК-, так и ДНК-мишени. При этом применяется один и тот же протокол ОТ-ПЦР;
— Гибкость при выборе метода детекции амплифицированного продукта: флуоресцентные зонды или интеркалирующие красители;
— Устойчивость к ингибиторам ОТ-ПЦР в концентрациях, характерных для НК, выделенных стандартными методами.
Рекомендации по использованию
Предназначены для использования с ген-специфичными праймерами;
Рекомендуемая длина ампликонов – до 300 п.о.;
Рекомендуемое количество РНК на одну реакцию – до 300 нг.
